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題目：上皮和基質(zhì)角膜硬度的變化隨年齡和肥胖而發(fā)生
（如果需要完整文獻(xiàn)請與我們工作人員聯(lián)系，可試樣）
簡介：
角膜是無血管的，這使其成為研究基質(zhì)蛋白表達(dá)和組織硬度的模型。角膜上皮粘附在基底區(qū)，下面的基質(zhì)由角質(zhì)細(xì)胞和廣泛的膠原蛋白和蛋白聚糖基質(zhì)組成。我們的目標(biāo)是檢查8周和15周小鼠的角膜變化，并將其與15周前2型糖尿病肥胖小鼠進(jìn)行比較。對角膜上皮進(jìn)行納米壓痕原位，然后對上皮進(jìn)行磨損，并在基底膜和基質(zhì)上重復(fù)該過程。進(jìn)行共聚焦成像以檢查蛋白質(zhì)的定位。發(fā)現(xiàn)僵硬取決于年齡和肥胖。與8周小鼠相比，15周小鼠上皮的楊氏模量更大。在15周時，對照組的上皮明顯大于肥胖小鼠的上皮。Crb3和PKCζ在頂端上皮的定位存在差異，肥胖小鼠缺乏片狀延伸。在2型前糖尿病肥胖小鼠中，硬度斜率存在差異，損傷后纖連蛋白的定位可以忽略不計。這些表明，飲食引起的年齡和環(huán)境變化會隨著年齡的增長而改變組織的完整性，使其更僵硬。來自2型前糖尿病肥胖小鼠的角膜明顯較軟，這可能是由于頂端表面蛋白質(zhì)的變化表明缺乏完整性和纖連蛋白減少。
角膜上皮和基質(zhì)硬度用Piumanano壓痕系統(tǒng)（Optics11，阿姆斯特丹，荷蘭）測量。為了進(jìn)行測量，頭部被固定。將眼睛浸入磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并將探針降低到角膜的中心。探頭的半徑為26μm，剛度為4.4 N / m。通過10μm壓痕進(jìn)行上皮測量。
為了檢查基底膜和基質(zhì)，對上皮進(jìn)行了磨損。使用各種壓痕深度進(jìn)行測量，范圍從1μm到17μm。使用基于赫茲接觸力學(xué)模型的內(nèi)置PIUMA軟件計算樣品的楊氏模量，假設(shè)角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。加載曲線通過軟件擬合到以下方程中：其中F表示施加的力，表示有效楊氏模量，表示球尖半徑，并表示壓痕深度。我們用于分析的體積楊氏模量是使用以下公式生成的：其中表示被測材料的泊松比。
3. 結(jié)果
在接下來的實驗中，我們將8周和15周的小鼠與天然發(fā)生的小鼠肥胖模型（2型糖尿病小鼠前）進(jìn)行了比較，以檢查上皮和基質(zhì)硬度的變化。使用來自5只8周對照小鼠，5只15周對照小鼠和2只DiO 15周齡小鼠的雙眼。之前，我們證明了肥胖小鼠角膜的角膜上皮傷口修復(fù)受損[。這些結(jié)果刺激我們檢查角膜的變化，這可能是細(xì)胞遷移和傷口修復(fù)變化的根本原因。在中，我們檢查了完整眼睛中上皮，基底膜和基質(zhì)的硬度。計算Young氏模量，15周C57Bl6小鼠的完整角膜上皮顯著大于8周小鼠的完整角膜上皮（Wilcoxon秩和檢驗，*** p < 0.01）。在同等年齡時，上皮顯著大于年齡匹配的DiO小鼠角膜（Wilcoxon秩和檢驗，*** p < 0. 01）。在這里，小鼠的背景相似，DiO小鼠被喂食高脂肪飲食15周。
圖1.8周對照的角膜上皮硬度（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差），假設(shè)角膜組織不可壓縮，泊松比為0.5。
角膜是的，因為它作為眼睛的折射表面發(fā)揮著基本功能，同時也在眼睛和外部環(huán)境之間保持了不透水的屏障。我們已經(jīng)表明，僵硬的變化隨著年齡的增長以及肥胖小鼠（DiO）而發(fā)生，這是II型糖尿病前期的模型。之前，我們證明了DiO小鼠的角膜愈合速度明顯慢于對照C57BL6小鼠的角膜[]。我們在本手稿中的數(shù)據(jù)支持一份報告，即與對照組相比，糖尿病前期患者的角膜表面疾病發(fā)病率增加（分別為20.67%和3.33%;p < 0.05） []。
我們證明，年齡匹配的動物的上皮硬度與年齡和飲食有關(guān)。由于DiO動物的上皮不那么堅硬，我們反映了上皮完整性的變化，并對頂端上皮中常見的極性蛋白進(jìn)行了染色。我們檢查了未受傷和受傷的角膜，因為平面極性可以通過幾種不同的線索引發(fā)，包括生長因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)的變化]。這些線索被認(rèn)為被轉(zhuǎn)化為定向遷移，這需要通過信號通路重組細(xì)胞成分。這些蛋白質(zhì)通常局限于遷移細(xì)胞的前部，導(dǎo)致細(xì)胞骨架變化，前緣膜突起和定向運(yùn)動[這些變化在對照中觀察到，并在DiO角膜中被修改。先前，在其他組織中發(fā)現(xiàn)Crb3在分化的分泌細(xì)胞和分化的纖毛細(xì)胞中定位于頂端表面]。
在基底膜和基質(zhì)中也檢測到剛度的差異，通過基質(zhì)的剛度變化百分比發(fā)生變化。所有測量均在中央角膜中進(jìn)行。剛度變化的原因尚不清楚[]。表明隨著年齡的增長，結(jié)締組織的特征是晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的積累，并且糖尿病患者受其積累的影響更大。這很重要，因為它可以改變基質(zhì)中豐富的蛋白質(zhì)（如膠原蛋白）的糖基化。他們對體外肌腱的研究表明，AGEs會降低組織的粘彈性。關(guān)于AGEs隨時間積累及其對膠原纖維和蛋白聚糖間距的影響的數(shù)據(jù)尚不清楚。
在最近的一篇綜述中，McKay等人指出，膠原蛋白交聯(lián)提供了維持角膜完整性的強(qiáng)度，衰老和糖尿病與膠原交聯(lián)的增加有關(guān)[]。然而，該評價隨后指出，雖然糖尿病人群的角膜滯后和角膜阻力因子升高，但存在不一致之處，他們提出這是由于人類患者群體的異質(zhì)性。糖尿病人群中的一致性極難控制，原因包括疾病的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間。出于這個原因，隨著時間的推移，對幾種不同的小鼠糖尿病模型的研究將很有趣，以解決這個問題。McKay確實報告了基質(zhì)厚度增加，根據(jù)研究的不同，剛度沒有或中度增加。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)DiO角膜Kneer等人（2018）的基質(zhì)厚度增加。
其他研究者假設(shè)這種增加與糖尿病有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在其隊列中，LOX與糖尿病或肥胖無關(guān)[]。雖然我們測量了僵硬，但我們沒有測量LOX，需要在飲食的不同時間在DiO小鼠中檢查其表達(dá)。事實上，他們的體外研究表明，升高的LOX與缺氧的關(guān)聯(lián)更大。此外，Mankus等人（2012）在P2X7敲除小鼠中證明，LOX與III型膠原蛋白一樣升高，并不表示交聯(lián)增加[]。然而，在DiO小鼠和糖尿病人角膜中，P2X7 mRNA顯著升高7-10倍[。這種升高表達(dá)的功能含義尚不清楚。在我們目前的研究中，沒有進(jìn)行膠原纖維測量，未來的研究將進(jìn)一步檢查基質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)。蛋白聚糖的硫酸化可能會發(fā)生變化，因為這也可能影響剛度。
我們的研究表明，DiO角膜傷口愈合受損可能反映了硬度的差異或基質(zhì)分子（如纖連蛋白）的變化。在對照中，與DiO角膜相比，沿著基質(zhì)神經(jīng)和對照前緣檢測到纖連蛋白。缺氧角膜中檢測到纖連蛋白減少，與對照組相比，角膜愈合延遲[]。甚至有可能缺乏順應(yīng)性反映了纖連蛋白的減少，因為體外研究表明，纖連蛋白的拉伸會導(dǎo)致其展開，導(dǎo)致隱秘結(jié)合位點(diǎn)暴露[。納米壓痕儀在不同年齡和環(huán)境壓力下對相同背景的小鼠的使用為具有許多相互矛盾數(shù)據(jù)的領(lǐng)域提供了對照研究，因為人類模型非常復(fù)雜。隨著時間的推移，將對肥胖和非肥胖小鼠的2型糖尿病模型進(jìn)行其他研究，以進(jìn)一步測試我們的結(jié)果。識別改變角膜完整性的特定因素將用于治療和預(yù)防變化?？傊?，研究角膜的物理特征，如原位僵硬，可以深入了解控制和患病條件下傷口修復(fù)的機(jī)制。
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生物組織納米壓痕儀介紹
Piuma納米壓痕儀的核心部件是其安裝在壓痕移動平臺上極其敏銳的壓痕探頭
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生物組織納米壓痕儀是一個簡單易用的革命性產(chǎn)品，為軟物質(zhì)以及生物材料組織的微觀以及納觀研究帶來希望。依靠自身*的新型光學(xué)技術(shù)以及杰出的微加工工藝，Piuma納米壓痕儀可以測量楊氏模量軟的樣品，范圍甚至是從5Pa到5GPa!Piuma同樣非常適合在液體中測試樣品。其操作非常簡單易學(xué)，只需將探頭插入儀器中，簡單定標(biāo)后，即可馬上開始壓痕實驗。
產(chǎn)品構(gòu)件詳細(xì)介紹：
1.PROBE探頭
納米壓痕儀核心:一個微加工工藝制作的光學(xué)壓痕探頭
2.SAMPLE樣品
從水凝膠到骨組織等，在大氣中或者浸沒在液體中
3.SAMPLEXYSTAGEXY樣品臺
在X-Y（12x12mm）范圍內(nèi)測試樣品
4.INDENTATIONSTAGE壓痕移動臺
粗進(jìn)以及精進(jìn)移動臺實現(xiàn)精確壓痕以及自動尋找樣品表面
5.MANUALSTAGE手動平臺
為任何樣品以及容器創(chuàng)造空間
Piuma是一個創(chuàng)新的，具有成本效益的工具，用來表征生物材料、組織、細(xì)胞器、細(xì)胞層、軟骨、靜電支架、力學(xué)性能，3D打印材料，水凝膠等的微納米機(jī)械性能。
The Piuma 納米壓痕儀專為迎合生物材料以及組織研究人員和工程師的需求，提供易用性和便攜性，同時提供高精度、高通量和多樣化的數(shù)據(jù)。Optics11小型化的玻璃探針式壓頭，特別適合在液體中測量水合樣品。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的研究者，Piuma納米壓痕儀是衡量他們感興趣材料剛度的一個解決方案。
在生物材料、組織工程、再生醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，Piuma可以在溶液里進(jìn)行非破壞性測量測量某點(diǎn)或者某個區(qū)域的楊氏模量、蠕變和松弛實驗，點(diǎn)陣測量粘附力，描述應(yīng)變硬化行為，樣品的粘度等。測試生物材料和組織樣本的軟硬度可以很容易地在Piuma納米壓痕儀上用其optics11 PIUMA探頭和專用的Piuma軟件來實現(xiàn)。
Piuma Nanoindenter是荷蘭Optics11公司出品的新型生物納米壓痕儀。主要應(yīng)用范圍為生物組織、生物支架、水凝膠、聚合物、細(xì)胞等軟物質(zhì)以及生物材料的機(jī)械性能研究。采用了新型探頭設(shè)計，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)其他納米壓痕儀無法測試軟物質(zhì)的問題也解決了原子力顯微鏡在軟物質(zhì)測試中的數(shù)據(jù)波動大，操作困難、制樣嚴(yán)苛等常見問題。更開創(chuàng)性的在壓痕儀中加入了動態(tài)力學(xué)測試模式DMA，可以獲得材料與振動頻率相關(guān)的儲存模量、損失模量和損失因子，用于研究材料在交變力作用下的滯后現(xiàn)象和力學(xué)損耗。
